772.反向輸出

最終診斷 772.反向輸出

結直腸癌（CRC）是全球第三大常見癌癥，平均5年總生存率（OS）為60。原發性CRC可通過手術治愈；然而，在轉移階段，OS顯著降低。在轉移性結直腸癌（mCRC）中，患者接受治療性手術或圍手術期或姑息性化療和靶向治療。

在診斷時，20–30的患者患有同步肝轉移（LM），所有CRC患者中的50–75會發生肝轉移，這是導致死亡的主要原因。為了提高OS，我們需要進一步了解mCRC并確定其他治療靶點。雖然臨床前研究集中在原發腫瘤（pTU）和轉移過程，但臨床挑戰在于轉移患者的最佳治療。此外，沒有常用的免疫活性動物模型重現CRCpTU和轉移的生長，使得我們對于了解轉移性CRC充滿挑戰。

腫瘤細胞在復雜的微環境中生長，涉及驅動腫瘤生長、侵襲和轉移的細胞外和細胞內信號。組織力學特性的變化既可以先于疾病發展，也可以推動疾病發展，腫瘤“硬度”與幾種腫瘤類型的預后相關。先前的研究表明，包括乳腺癌和胰腺導管腺癌在內的幾種實體瘤的疾病進展與其彈性模量相關。

組織剛度是組織抵抗變形的程度，由應力和應變之間的關系描述。在組織水平上，剛度受細胞骨架和細胞外基質（ECM）的控制。纖維狀膠原蛋白是最豐富的ECM支架蛋白，對組織剛度有顯著影響。富含膠原蛋白I（COLI）的異常ECM重構已被確定為癌癥進展過程中組織硬化的主要原因。作為ECM的主要來源，癌相關成纖維細胞（CAF）通過表達賴氨酰氧化酶（LOX）來進一步改變腫瘤機械環境，賴氨酰氧化酶是一種胺氧化酶，可啟動膠原蛋白的共價內和分子間交聯過程。在實驗模型中，通過LOX抑制來抑制基質硬化可改善腫瘤生長并改善治療。因此，CAF被認為是限制癌癥進展的有希望的治療靶點。

腫瘤微環境在為腫瘤提供血液供應方面也起著關鍵作用。通過使用單克隆抗體、VEGF陷阱或多靶點酪氨酸激酶抑制劑靶向血管內皮生長因子（VEGF）信號通路來抑制mCRC血管生成。目前，療效不足和耐藥性限制了抗血管生成療法的益處。此外，內皮細胞（EC）根據機械環境調節其屏障能力和生長。具體而言，堅硬的基質促進EC增殖并可能導致血管完整性缺陷，這表明機械環境可能會影響腫瘤中的EC行為，從而影響抗VEGF的功效.本研究旨在闡明轉移性血管生成是否受機械微環境的影響，機械微環境可以通過mCRC中轉移相關的成纖維細胞（MAF）激活進行調節，以及是否可以改變這種MAF激活以提高抗血管生成治療的療效。

1、CRC中的MAF高度激活

在LM中觀察到aSMA、pMLC2和COLI的顯著更高表達，表明MAF的肌成纖維細胞和ECM重塑特征。

接下來，從CRC患者的pTU(CAF)和LM(MAF)中分離出原代成纖維細胞。MAF顯示出aSMA和pMLC2的顯著上調，證實了肌成纖維細胞和細胞收縮性信號的增加。FAs的量化顯示MAFs中FAs的平均面積更大（圖L和M），支持CRCMAFs被高度激活。

2、晚期CRC患者的ECM重構和硬化特征

為了鑒定與肝轉移相關的基因表達特征，我們對CRC患者的pTU和LM進行了RNA測序（RNAseq）。使用通路相互作用數據庫(PID)對LM中上調基因進行的基因集分析(GSA)揭示了整合素信號傳導的顯著富集。為了進一步表征成纖維細胞的基因表達，我們在成功富集后對分離的原代CAF和MAF進行了RNAseq。

我們鑒定了3，721個差異表達的基因。GO確定了MAF中上調的肌成纖維細胞/ECM重塑特征。KEGG確定了ECM受體相互作用和FA特征和PID確定了整合素信號（圖H）。此外，基因集富集分析(GSEA)還揭示了差異表達基因的肌動蛋白介導的細胞收縮、FA、ECM成分、肌生成和血管生成特征的強烈富集（圖IM）。

3、MAFs增加微環境硬度，支持血管生成

我們進行了凝膠重塑分析，并觀察到MAF顯示出更密集、更復雜的F肌動蛋白網絡（圖A），并且可以比CAF更大程度地收縮凝膠（圖B）。在新鮮和冷凍保存的組織中，我們觀察到LM的基質硬度顯著增加（圖CD）。基質硬度與來自同一患者的樣本中的COLI、aSMA和pMLC2表達相關（圖EG）。

基質硬化調節EC增殖、血管生成、血管生長和分支，為了研究這種聯系，我們評估了LM中的脈管系統，并觀察了基質硬度和CD31血管面積之間的相關性（圖H）。當在凝膠內培養時，允許成纖維細胞重塑基質，MAFs誘導EC發芽的程度顯著高于CAFs（圖IK）。因此，MAF支持伴隨局部ECM重塑的細胞因子產生血管生成。

4、腎素血管緊張素系統抑制目標成纖維細胞

對新鮮分離的MAF與肝源性成纖維細胞的qPCR分析顯示RAS系統的所有關鍵成分（血管緊張素原[AGT]、腎素[REN]、血管緊張素轉化酶[ACE]和AT1[AGTR1]的表達顯著增加）。此外，MAFs表達的AGT和AGTR1水平顯著高于CAFs（圖LO）。為了表征RAS靶向對MAF功能的影響，我們在用氯沙坦（一種AT1阻滯劑）或卡托普利（一種ACE抑制劑）治療后進行了凝膠收縮試驗。在低濃度（氯沙坦為1mM，卡托普利為5mM）和高濃度（氯沙坦為10mM，卡托普利為50mM）時，兩者都顯著降低了MAF凝膠收縮（圖PR）。

5、RAS抑制降低轉移基質硬度并重塑微環境

與無高血壓組和非RAS治療組2相比，接受抗RAS藥物治療的患者組織硬度顯著降低（圖AB）。進一步評估（通過對同一患者組中的COL1、aSMA和pMLC2染色）是否可以通過MAF激活的下調來解釋轉移剛度的差異。雖然高血壓與pMLC2染色的增加相關，但我們沒有觀察到對aSMA和COLI的影響（圖CH）。在所有組中，抗RAS治療顯示MAF激活和ECM沉積顯著減少（圖CH）。抗RAS藥物的作用獨立于特定的RAS抑制治療。觀察到轉移僵硬（不同條件±高血壓±抗RAS藥物）與COLI、aSMA和pMLC2表達之間呈正相關（圖IK），表明MAF激活水平有助于組織僵硬在LM。總之，接受抗RAS治療的患者顯示出低肌成纖維細胞/ECM特征，這解釋了轉移硬化的減少。

6、AT1R信號轉導通過RhoA介導MAF激活

接下來，作者想確定RAS抑制如何導致MAF激活減少。體外用氯沙坦或卡托普利處理MAF表明LOX和COL1A1mRNA表達降低（圖AB）。pMLC2在RAS抑制后也顯著減少（圖CD）。氯沙坦和卡托普利治療顯著降低了ARHGEF1的酪氨酸磷酸化，并導致活性RhoA減少（圖EH）。類似地，ARHGEF1的敲低導致pMLC2減少，支持血管緊張素ARHGEF1RhoA軸在MAF中的作用（圖IJ）。總的來說，我們結果表明RAS通路抑制劑通過抑制MAF主動收縮（圖K）以及減少膠原蛋白生成和交聯來阻止基質硬化，從而改善腫瘤纖維化過程。

7、RAS抑制增加了貝伐單抗的抗血管生成作用

基質硬度不受單獨貝伐單抗治療的影響（圖AB）。在Bev組中，與非RAS治療的高血壓患者和無高血壓患者相比，抗RAS治療導致組織硬度降低（圖A，C）。類似地，在Bev組中，在抗RAS治療的患者中也觀察到了相同的基質硬度降低（所有p＜0.001）（圖A，D）。此外，抗RAS治療組的硬度降低與特定治療無關。單獨的貝伐單抗治療不影響LM內的COLI、aSMA和pMLC2。為了評估抗血管生成治療（貝伐珠單抗治療）和RAS抑制對血管系統的綜合影響，我們測量了一大群CRCLM中的血管密度。與Bev組相比，Bev組的血管密度顯著降低了48.7±8.2。然而，與非RAS、Bev治療相比以及與所有Bev組。這與使用的RAS治療類型無關。因此，抗RAS藥物靶向組織硬度，從而影響貝伐單抗的療效。

8、通過RAS和血管生成抑制減少EC增殖

EC增殖隨硬度增加而增加，VEGF進一步誘導增殖，低硬度時VEGF效應最高（圖AC）。此外，我們分析了在不同密度的纖維蛋白原基質（剛度的代表）中存在或不存在VEGF的情況下EC發芽。EC發芽（芽的數量和長度）隨密度增加。VEGF導致在所有條件下進一步發芽，VEGF在軟基質中的作用更顯著，如EC增殖的情況。

為了了解抗RAS藥物和貝伐單抗的組合如何影響轉移灶內的EC，我們量化了它們對EC增殖的影響。單獨的貝伐單抗治療導致EC增殖減少56.1±11.0。由于轉移僵硬與獨立于治療的轉移內的EC增殖相關，我們評估了RAS抑制是否足以減少EC增殖。在未接受抗血管生成治療的患者中，RAS抑制并未顯著降低EC增殖；然而，在接受貝伐單抗和抗RAS藥物治療的患者中，EC增殖進一步降低了78.1±9.2）。

9、RAS和血管生成抑制改善血管完整性

有趣的是，VEGF和基質硬化都有效地導致血管通透性。為了進一步表征抗RAS藥物對血管完整性的作用，我們通過對緊密連接蛋白ZO1（封閉小帶1）進行免疫染色分析了它們對EC連接穩定性的影響。雖然建議貝伐單抗治療導致消除未成熟血管，但我們觀察到貝伐單抗對ZO1緊密連接沒有變化（圖AB）。與之前在其他疾病模型中的發現一致，即增加基質剛度可增強內皮通透性，我們還觀察到ZO1覆蓋率與CRCLM的組織硬度之間存在負相關，表明在更硬的LM(圖C)。在接受抗RAS藥物治療的Bev患者中，我們還觀察到EC中ZO1覆蓋率的增加，表明單獨的抗RAS足以改善內皮連接穩定性（圖A，D）。然而，在聯合治療（Bev和抗RAS）中，對連接穩定性的影響大大增強（圖A，E）。

KLF2是一種剪切應力響應轉錄因子，其表達隨層流剪切應力增加，是灌注的標志。抗血管生成治療沒有改變內皮細胞中KLF2的表達（圖FG）。然而，KLF2表達與組織剛度呈負相關，表明基質硬度增加會損害灌注（圖H）。在未接受貝伐珠單抗治療的患者中，KLF2表達未因抗RAS治療而改變（圖FI），但在抗RAS和貝伐單抗治療的患者中顯著更高（圖F、J）。

10、內皮細胞YAP/TAZ是受LM基質硬度和VEGF調節的中樞

然后我們使用EC核標記ERG1分析了患者樣本中的ECYAP/TAZ激活狀態。抗血管生成治療導致YAP/TAZEC硬度降低（圖K，L），表明VEGF信號是LM中EC中YAP/TAZ易位所必需的。然而，與非高血壓患者以及接受貝伐珠單抗和非RAS藥物治療的患者相比，貝伐珠單抗治療同時停用VEGF的同時降低僵硬度降低了核YAP/TAZ強度（圖K，N），與RAS抑制的類型無關。最相關的是，我們觀察到接受LM切除術并在疾病過程中接受抗血管生成治療并同時進行抗RAS治療的患者的OS顯著延長。這通過多變量Cox回歸分析得到證實（圖O）。綜上所述，抗血管生成治療聯合RAS抑制顯著抑制內皮YAP/TAZ激活和轉移性血管生成。

研究優點：

①腫瘤受到其微環境的機械特性的影響。利用患者樣本和原子力顯微鏡，我們發現肝轉移瘤的組織硬度高于原發性結直腸腫瘤。高度活化的轉移相關成纖維細胞增加了組織的硬度，從而增強了血管生成和抗血管生成治療的抵抗力。

②針對腎素血管緊張素系統的藥物通常用于治療高血壓，可抑制成纖維細胞收縮和細胞外基質沉積，從而減少肝轉移瘤硬化，并增加貝伐單抗的抗血管生成作用。

③接受貝伐單抗治療的患者在同時接受腎素血管緊張素抑制劑治療時存活時間延長，這突顯了調節治療方案的機械微環境的重要性。

研究局限性：

①對于接受貝伐單抗治療的結直腸癌和肺癌患者，貝伐單抗治療本身就能誘發高血壓。在該研究中并未對與貝伐單抗無關的高血壓及貝伐單抗導致的高血壓進行區分。